Laporan Inkulasi Bakteri

LAPORAN 

INKULASI BAKTERI

ELFIAN PERMANA

BAB I

PEMBAHASAN

1.1 Latar Belakang

Dalam kehidupan manusia tidak lepas dari yang nama microorganisme terutama bakteri Bakteri yang merupakan mikroba prokariotik uniselular, termasuk class Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Cara hidup bakteri ada yang dapat hidup bebas, parasitic, saprofitik, pathogen pada manusia, hewan dan tumbuhnan. Habitatnya tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer ( sampai 10 km di atas bumi ), di dalam lumpur dan di laut.

            Berdasarkan klasifikasi artifisial yang dimuat dalam buku “Bergey’s manual of determinative bacteriology” tahun 1974, bakteri diklasifikasikan berdasarkan deskripsi sifat morfologi dan fisiologi. Menurut Bergey’s manual, bakteri dibagi menjadi 1 kelompok (grup), dengan Cyanobacteria pada grup 20. Pembagian ini berdasarkan bentuk, sifat gram, kebutuhan oksigen, dan apabila tidak dapat dibedakan menurut ketiganya maka dimasukkan ke dalam kelompok khusus.

Media adalah suatu bahan atau susunan bahan yang terdiri dari nutrisi atau zat-zat makanan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba (bakteri). Media pertumbuhan atau pembiakan diperlukan untuk mempelajari sifat bakteri untuk dapat mengadakan identifikasi, determinasi, atau diferensiasi jenis-jenis yang ditemukan.

             Medium pembiakan yang digunakan untuk mengembangbiakkan bakteri di laboratorium dapat dibedakan menjadi tiga yaitu; medium pembiakan dasar, medium pembiakan penyubur, medium pembiakan selektif, dan cara mendapatkan biakan murni.

Di alam Mikroba atau bakteri lebih sering ditemukan dalam bentuk koloni dan bersama-sama dengan mikroba yang lain. Oleh karena itu, dalam mempelajarinya, bakteri harus diambil dari alam lalu diisolasikan dalam suatu biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang hanya berisi 1 jenis bakteri.

Dalam pengisolasian bakteri ada beberapa macam cara yaitu; cara pengenceran, cara penuangan, cara penggesekan atau penggoresan, cara penyebaran, cara pengucilan 1 sel, dan cara inokulasi pada hewan.

1.2 Tujuan

            Tujuan dari praktikum yang dilakukan yaitu untuk membuat media pertumbuhan dan melihat morfologi serta sifat bakteri dengan jalan isolasi bakteri  pewarnaan gram dan dapat membedakan gram positif dan gram negatif.

II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bakteri

Bakteri (dari kata Latin bacterium; jamak: bacteria) adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel.Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri.Struktur sel bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel, dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Hal inilah yang menjadi dasar perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks.

Bakteri dapat ditemukan di hampir semua tempat: di tanah, air, udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit (patogen), bahkan dalam tubuh manusia. Pada umumnya, bakteri berukuran 0,5-5 μm, tetapi ada bakteri tertentu yang dapat berdiameter hingga 700 μm, yaitu Thiomargarita. Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur, tetapi dengan bahan pembentuk sangat berbeda (peptidoglikan). Beberapa jenis bakteri bersifat motil (mampu bergerak) dan mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel.

2.1.1 Gram Positif

Gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. Disisi lain, bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram. Prosedur ini ditemukan pada tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri. Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90 persen dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membrane luarnya

.

2.1.1 Gram negatif

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop. Disisi lain, bakteri gram-positif akan berwarna ungu. Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram. Prosedur ini ditemukan pada tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri. Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90% dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya. Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang.[4]Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin)

 

2.2 Autoklaf

Autoklaf adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (1210C, 15 lbs) selama kurang lebih 15 menit.Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf[1]. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh microorganisme. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65 °C.

Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121 °C[3]. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 10-15 menit[1]. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mencapai suhu sterilisasi[1]. Performa autoklaf diuji dengan indicator biologi, contohnya Bacillus stearothermophilus.

2.3 Mikropipet

Mikropipet (micropipet) adalah suatu alat yang digunakan untuk memindahkan cairan dalam jumlah kecil secara akurat. Penggunaan pipet gelas seperti pipet ukur dan pipet gondok tidak mempunyai akurasi yang tinggi untuk volume kurang dari 1 ml. Sehingga pada pemindahan cairan dengan volume kecil kurang dari 1000 microliter, orang cenderung menggunakan mikropipet, biasa juga disebut dengan pipet otomatis. Pipet otomatis ini mempunyai akuraritas dan presisi yang lebih baik dari pada pipet gelas. Disamping itu setiap pipet dapat diset berapapun volumenya selama dalam range volume pipet. Ada beberapa macam merek mikropipet yang beredar dipasaran seperti Gilson, Pipetman, dll. 

Meskipun produk mikropipet telah dirancang akurat dan presisi oleh pabriknya, alat tersebut tetap harus dikalibrasi jika digunakan untuk laboratorium yang terakreditasi.

 Ada beberapa macam mikropipet yang biasa dipakai di laboratorium, seperti misalnya merk Gilson ada tertulis P20, P200 dan P1000 pada kepala pipet.

Macam-macam ukuran mikropipet

 P20 dimaksudkan untuk memipet larutan pada volume antara 2 - 20 ul

 P200 untuk memipet larutan pada volume antara 20 – 200 ul

P1000 untuk memipet larutan pada volume antara 100 – 1000 ul

Bagian-bagian mikropipet

Bagian-bagian dari mikropipet terdiri dari Automatic Pipettor dan Pipette tips. Automatic Pipettor berfungsi untuk memompa cairan yang akan dipindahkan dengan volume yang telah diset, sedang Pipette tips merupakan pasangan mikropipet yang berfungsi untuk menampung cairan yang dipompa.

Pengoperasian Mikropipet

 Ada beberapa tahapan untuk mengoperasikan mikropipet secara benar yang antara lain :

 Set volume

1.      Pasang tip disposable

2.      Tekan penyedot sampai pembatas pertama

3.      Masukkan tip ke sampel

4.      Ambil sampel

5.      Tahan

6.      Tarik tip

7.      Keluarkan sampel

8.      Tarik pipet

9.      Lepaskan tekanan penyedot

10.  Lepaskan tip

III METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Pelaksanaan praktikum tentang Inkulturasi bakteri  pada hari Senin dan selasa tanggal 2-3 Mei 2013 jam 09.00 – 12.00 di Laboratorium Departemen perikanan, PPPPTK Pertanian Cianjur, Jawa Barat Indonesia.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

1)      Autoklaf

2)      Mikropipet

3)      Mikroskop

4)      Loop

5)      Kaca objek

6)      Jarum inokulasi

7)      Mikroskop

3.2.2 Bahan

1)      Biakan bakteri

2)      Tissue

3)      Aquades steril

4)      Perwarna dasar Kristal violet

5)      Larutan pengikat warna dasar : larutan iodine

6)      Larutan pencuci warna dasar : alcohol 70 %

7)      Pewarna pebanding : larutan safranin

8)      Biakan murni bakteri

3.3 Langkah Kerja

3.3.1 Pengsterilan alat

1.          Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dengan autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuk kerak dan karat.

2.          Masukan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka tutup harus dikendorkan.

3.          Tutupautoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan di kencangkan terlebih dahulu.

4.          Nyalahkan autoklaf, di atur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121^oC

5.          Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejk tekanan mencapai 2 atm.

6.          Jika alarm tanda sesuai bunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara dilingkungan (jaarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

3.3.2 Mikropipet

1.          Sebelum digunakan thumb knop sebainya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet

2.          Masukan tip bersih ke dalam nozzie / ujung mikropipet

3.          Tekan thumb knob sampai hambatan pertama / first stop, jangan diletakan lebih ke dalam lagi.

4.          Masukan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm.

5.          Tahan pipet dalam osisi vertical kemudian lepaskan tekanan tekanan dari thumb knop maka cairan akan masuk ke tip.

6.          Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan.

7.          Tekan thumb knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip.

8.          Jika ingin melepas tip putar thumb knop searah jarum jam dan tekan maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar.

3.3.3 Metode penanaman dengan goresan sinambung

1.          Sentuhkan inoculum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai seteengah permukaan agar

2.          Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180^oC lanjutkan goresan sampai habis

3.          Goresan sinambung umumnya digunakan untuk mendapaatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru

3.3.4 Metode penanaman goresan T

1.          Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker

2.          Inokulasi daerah 1 dengan streak zig zag

3.          Panaskan jarum inoulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig zag

Pada daerah 2 (steak pada gambar)

4.          Cawan di putar untuk memperoleh goresan yang sempurna

5.          Lakukan hal yang sama pada daerah 3

3.3.5 Metode goresan kuadran

1.          Bagi cawan menjadi 4 kuadran menggunakan spidol marker

2.          Inokulasi daerah 1 streak zig zag

3.          Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin

4.          Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah pisah menjadi koloni tunggal

5.          Cawan di putar untuk memperoleh goresan yang sempurna

6.          Lakukan hal yang sama pada daerah 3 dan 4

                   

3.3.6 Mengamati hasil biakan bakteri yang sudah diinkubasi, meliputi

1.             Ukuran ; pinpoint/puctiform (titik)

2.             Bentuk koloni

3.             Elevasi koloni

4.             Permukaan koloni

5.             Margins

3.3.7        Penentuan Gram bakteri menalaui teknik pewarnaan

3.3.7.1  Pembuatan Biakan Fiksasi

A.      Cair :

1.          Subpensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakan pada kaca objek

2.          Lalu hapuskan pada kacaa objek selebar 4-5 cm

3.          Biarkan mongering di udara atau panas kena api kecil dengan jarak 25 cm.

B.      Padat

1.       Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas nyala api Bunsen

2.       Teteskan setetes aquades steril diatas kaca tersebut

3.       Secara aseptic, ambillah inoculum bakteri yang akan diperiksa, lalu letakan diatas tetesan aquades, kemudian ratakaan perlahan-lahan.

4.       Ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata

5.       Biarkan kering

6.       Fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut di atas nyalaa api dengan cepat

3.3.7.2  Pewarnaan

1.    letakan apusan di atas kawat penyangga yang berada di atas mangkuk perwarna. Lalu teteskan larutan Kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30 - 60 detik.

2.    cuci warna dasar dengan air mengalir, keringkan

3.    teteskan larutan iodine dengan air mengalir, keringkan

4.    cuci larutan iodine dengan air mengalir, keringkan.

5.    rendam atau basuh dengan 70 % alcohol selama 15 detik.

6.    teteskan larutan safranin, biaarkan selama 30 – 60 detik.

7.    cuci dengan air mengalir, lalu keringkan.

8.    amat dengan mikroskop.

9.    gambar bentuk morfologinya!

3.3.8. Penentuan bakteri dengan KOH 3 %

1.       Teteskan larutan KOH 3 % ke gelas objek yang telah disediakan

2.       Setelah sudah di teteskan masukan sample bakteri ke gelas objek

3.       Ratakan smple tersebut

4.       Liat apakan larutan KOH nya tersebut berlendir atu tidak

5.       Jika berlendir gram negative jika tidak gram positif

IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

               

No	Sample	Form	Elevation	margin	KOH 3 %
1	Hati	Circular	Raised	Entire	Berlendir
2	Air I	Circular	Covex	Lobate	Berlendir
3	Air II	Circular	Crateriform	Undulate	Berlendir
4	Limpa	Circular	Raised	Filiform	Berlendir
5	Ginjal	Circular	Raised	Undulate	Berlendir
6	Darah	Circular	crateriform	Undulate	Berlendir

4.2 Pembahasan

                Setiap makluk hidup terdapat bakteri tidak terkecuali ikan. Bakteri yang gram negative akan berwarna merah dan yang gram negative akan berwarna violet. Pada tahap pertama NA merupakan media pengaya yang dapat memperbanyak bakteri, baik yang ada dalam specimen maupun koloni-koloni bakteri. Jadi media sangat baik untuk mengidentifikasi bakteri apa yang ditanam pada media, karena media ini tidak menghambat pertumbuhan bakteri jenis apapun yang ada pada media.

 penanaman dan isolasi bakteri  yang diambil dari sampel yang tidak diketahui jenis bakteri apa. Pada saat penanaman dilakukan dengan metode goresan langsung. Goresan pertama dirapat-rapatkan atau ditebalkan baru kemudian dijarang-jarangkan atau dibuat zig-zag seperti. Ini dilakukan untuk menghindari agar koloni bakteri yang satu dengan yang lainnya tidak saling menumpuk. Isolasi bakteri berT atau spiral dalam tujuan untuk memudahkan dalam mempelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Koloni yang tumbuh menunjukkan cirri-ciri yaitu; putih, bulat, sedang- besar, cembung. Kemudian dilakukan pewarnaan gram untuk menentukan morfologi dan sifat dari bakteri yang di ambil dari koloni bakteri pada media NA. Dan setelah diidentifikasi dengan pewarnaan gram, ditemukan bakteri gram negative berwarna merah. From lebih banyak circular berbentuk seperti bulat. Dikarenakan semua gram negative pada saat pelarutan KOH 3 % bakteri berlendir bertanda bahwa gram negative.

V PENUTUP

5.1       Kesimpulan

                Media agar merupakan media yang mudah untuk pembiakan bakteri. Dengan mestrake bakteri dapat terlihat pembiakan bakteri dan gram positif akan berwarna violet sama seperti warna dasar sedangkan gram negtif akan berwarna merah . pada saat pemberian KOH 3 % bakteri akan berlendir pada saat di aduk dengan KOH. Pewarnaan gram dlakukan untuk menentukan morfologi dan sifat dari bakteri yang di ambil dari koloni bakteri.

5.2 Saran

                Dalam hal dunia aquakultur bakteri ada yang baik maupun yang jahat. Dalam hal itu bakteri yang baik sebaikannya dikembangkan lebih lanjut agar membantu dalam prosesbudidaya perikanan.

DAFTAR PUSTAKA

gurungeblog.wordpress.com/2008/11/17/bakteri-ciri-ciri-struktur-perkembangbiakan-bentuk-dan-manfaatnya/

infonesiia.wordpress.com/patogen-tumbuhan-2/bakteri/

id.m.wikipedia.org/wiki/Gram-negatif

id.m.wikipedia.org/wiki/Gram-positif

id.m.wikipedia.org/wiki/Autoklaf